Tinción de Ziehl Neelsen

Fundamento

Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de lo ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y la que no se ven de color azul, ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste.

El procedimiento es el siguiente:

a) Filtre la fucsina fenicada antes de usarla.

b) Cubra la superficie del extendido con fucsina.

d) Elimine la fucsina con agua del tubo a baja presión, de manera que la película no se desprenda.

e) Gire la lámina para lavar su cara inferior y así eliminar la fucsina ahí depositada.

f) Cubra la superficie del extendido con alcohol-ácido al 3% efectuando un movimiento de vaivén y espere 2 minutos de modo que el alcohol-ácido lo decolore y arrastre suavemente la fucsina. Esta operación puede repetirse hasta que sobre el extendido se observe un color rosado.

g) Lave la lámina con agua según se describe en el punto d.

h) Cubra el extendido durante 1 minuto con solución de azul de metileno.

i)   Lave ambas caras de la lámina con agua.

j)  Seque las láminas a temperatura ambiente, en posición vertical, con el extendido hacia el frente.

k) Revise la identificación de los frotis y rotúlelos de nuevo si se borraron durante la tinción.

Observación microscópica

·      La observación microscópica debe determinar la presencia de  BAAR (concordancia cualitativa) y establecer su número aproximado por campo microscópico (concordancia cuantitativa).

·      Considere campo microscópico útil aquel en el cual se observan elementos celulares de origen bronquial (leucocitos, fibras mucosas y células ciliadas).   Los campos en que no aparezcan dichos elementos no deben contabilizarse en la lectura.

·      Observe cada campo microscópico, en superficie y profundidad, con objetivo de inmersión

·      Establezca una pauta uniforme de observación

·      El número de campos que se debe observar variará según la cantidad de bacilos que contenga la muestra.   Si no se encuentran BAAR o se observa menos de 1 bacilo por campo en promedio, deben examinarse por lo menos 100 campos.   Si se encuentran de 1 a 10 BAAR por campo en promedio, es suficiente observar 50 campos.   Si se encuentran más de 10 BAAR por campo en promedio, basta con observar 20 campos.

·      Cuando aparecen grumos de bacilos se debe contar como uno. Si el número de grumos que aparece es significativo, se debe hacer la observación en el reporte: “hay BAAR en grumos”, para indicar que el número verdadero de BAAR puede ser mayor que el que se reporta.

·      Cuando el frotis es de otro tipo de muestra, que no sea esputo o del sedimento de un esputo, solamente se reporta cualitativamente.

Reporte de resultados

Negativo (-): ° No se encuentran BAAR en 100 campos observados (c.o.). o si se encuentran menos de 3 BAAR en 300 campos ópticos observados.

Número exacto: de 1-9 BAAR en 100 campos observados.

Positivo (+): Promedio de menos de 1 BAAR por campo, en 100 campos observados. Lo que es lo mismo, de 10 a 99 BAAR en 100 campos

Positivo (++):  Promedio de entre 1 a 10 BAAR por campo, en 50 campos observados.

Positivo (+++):  Promedio de más de 10 BAAR por campo, en 20 campos observados.

Ejemplos:

Si observa 24 BAAR en 100 campos ópticos: 24/100=0,24 Lo que implica menos de 1 y corresponde reportar: BAAR positivo (+).

Si observa 5 BAAR en 100 campos ópticos: Lo que implica  de 1-9 en 100 campos observados  y corresponde reportar: Positivo (5) BAAR en 100 campos.